Test de détection "Interaction ligand-récepteur"

Il s'agit du nom donné à l'un des tests de détection in vitro des ciguatoxines, utilisé par le Laboratoire de recherche sur les micro-algues toxiques, qui est basé sur la capacité des ciguatoxines (considérées ici comme le ligand) à se fixer sur des récepteurs de nature protéique, présents en grande quantité au niveau des membranes de cellules nerveuses.

Le principe de la méthode

 

Le récepteur canal sodium

 

Le canal sodium est une protéine trans-membranaire présente en grande quantité au niveau des membranes des cellules excitables qui laisse passer sélectivement les ions sodium. L’analyse de ce canal, purifié à partir de cerveaux de rat, a montré qu’il était constitué de trois sous-unités. Le schéma ci-contre représente la sous-unité alpha (α  260 kDa) associée aux sous-unités béta 1 (β1 36 kDa) et béta 2 (β2 33 kDa). La sous-unité β1 est liée à la sous-unité α par des liaisons non covalentes alors que la sous-unité β2 est liée par des ponts disulfures (S-S). Les trois sous-unités sont fortement glycosylées sur la face externe de la molécule et la sous-unité α possède de nombreux sites de phosphorylation (P) au niveau de sa surface interne.

 Fixation spécifique à haute affinité sur le site 5
de la sous-unité
α du canal sodium
(schéma modifié d’après Catterall 1986)
 

Les sites de fixation des toxines marines (STX, TTX, PbTx, CTX, …..)

Des études pharmacologiques de compétition, de mesure du flux ionique (22Na) et de mutagenèse ont permis d’identifier sur les canaux sodium de mammifères six sites récepteurs, numérotés de 1 à 6. Ces sites sont les récepteurs de fixation de nombreuses neurotoxines associées au canal sodium activé par le potentiel d’action.

Le site 5 de la sous-unité alpha du canal sodium est le récepteur de 2 familles de toxines marines de type polyéther : les ciguatoxines (CTXs) et les brévétoxines (PbTxs), synthétisées respectivement par les dinoflagellés Gambierdiscus spp. et Karenia brevis.

La propriété de ces toxines de se fixer de façon spécifique sur le site 5 du canal sodium a permis d’élaborer un test de détection dit « Interaction ligand-récepteur ». Ce test permet ainsi de détecter et doser les CTXs présentes dans un échantillon d'algue ou de poisson.

Le principe théorique

Si un radioligand (L*) est mis en présence de son site récepteur (R), un complexe radioligand-récepteur se forme. Un équilibre s’établit entre ces deux états qui peut s’exprimer par l’équation suivante : [L*] + [R] ⇔ [L*-R].

Si on ajoute à ce mélange des concentrations croissantes de molécules inhibitrices non marquées qui entrent en compétition avec le radioligand, la quantité de récepteur disponible va diminuer, ce qui se traduit par une diminution de la quantité de complexe marqué formée. La courbe représentant le pourcentage de complexe formé en fonction de la concentration en inhibiteur (I) en échelle semi-Log est une sigmoïde.

   
Schémas modifiés d'après Bottein Dechraoui 1999

 

 Le test en images

Les différentes étapes de ce test suivent le protocole de Dechraoui et al. (1999).

 

Etape 1

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Etape 2 

 

 

Etape 3

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Etape 4

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Etape 5

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Obtention et purification des canaux sodium

Actuellement, les canaux sodium sont obtenus à partir de préparations membranaires issues des cellules excitables de cerveaux de rat, appelées aussi synaptosomes, provenant de cerveaux de rat. Le protocole utilisé est basé sur celui de Dodd et al. (1981) dont voici les grandes étapes :

  • Commande de cerveaux de rat congelés auprès d’une animalerie agréée

Préparation des homogénats de cerveaux suivie de 3 centrifugations selon le schéma suivant (modifié d'après Bottein Dechraoui 1999) :

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  • Le dosage en protéines des synaptosomes est réalisé selon la méthode de Bradford, la concentration optimale nécessaire au test de détection se situant entre 60 à 80 mg/ml de protéines.

 

Réglementation relative à la manipulation des radioéléments à l’ILM

Le test de détection « interaction ligand-récepteur » nécessite l’utilisation d’une toxine radiomarquée : la brévétoxine tritiée, [3H]PbTx-3.

L’utilisation de radioéléments ne s’improvise pas et repose sur l’application des textes émis par l’Union Européenne sous le nom EURATOM. La réglementation et les normes françaises résultent de la transposition de ces textes européens ainsi que des directives de la Commission Internationale de protection radiologique (CIPR).

Pour cela, une personne compétente en radioprotection doit être formée auprès d’un organisme agréé comme l’Institut National des Sciences et Techniques Nucléaires (INSTN) et un dossier de demande d’autorisation de détenir et de manipuler des radioéléments doit être soumis à l’Inspection du Travail de Polynésie française (Fiche 1).

Ainsi, l’Institut Louis Malardé a obtenu une autorisation de détenir et de manipuler des radioéléments concernant une source non scellée de brévétoxine tritiée jusqu’au 26 avril 2012. 

Les déchets radioactifs engendrés par toute manipulation font l’objet d’une procédure d’évacuation réglementée auprès de l’Agence Nationale pour la gestion des Déchets Radioactifs (ANDRA) (Fiche 2). Il existe plusieurs catégories de déchets et ceux-ci doivent être conditionnés dans des fûts conformes.

 

Bibliographie

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