PCR en temps réel

La PCR en temps réel utilise le principe de base de la PCR classique (amplification cyclique d’un fragment d’ADN, basée sur une réaction enzymologique) avec pour différence une amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel.
A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits. Ceci permet d’obtenir une cinétique de la réaction et donc la quantification de l’ADN alors que la PCR classique ne donne que la mesure finale.

Méthodes de détection

Plusieurs systèmes de détection sont utilisés pour la détection ou la quantification du signal fluorescent en temps réel. Ils sont divisés en 2 groupes : les agents intercalants et les sondes.

Agents intercalants

Russel Higuchi fut l’un des premiers à faire une mesure cinétique de la PCR au début des années 90. Il utilisait le bromure d’éthidium comme agent intercalant, c'est-à-dire une molécule capable de s’insérer entre les bases appariées d’un acide nucléique. Actuellement, l’agent intercalant le plus utilisé est le SYBR®Green, plus sensible et moins toxique que le bromure d’éthidium.
L’agent intercalant utilisé dans une PCR en temps réel, peu fluorescent à l’état libre, doit d’une part augmenter en fluorescence lorsqu’il est lié à l’ADN double brin et, d’autre part, ne pas inhiber la réaction de PCR. L’augmentation de la fluorescence mesurée pendant l’étape de polymérisation est proportionnelle au nombre de produits amplifiés formés (amplicons). L’émission fluorescente décroît complètement lors de l’étape de dénaturation du cycle suivant.

 

Dans ce système, la spécificité de la réaction ne repose que sur la spécificité des amorces, sans contrôle de la taille des amplicons. Pour vérifier qu’un seul produit PCR a été amplifié, on réalise une courbe de fusion en fin de réaction.
La technique utilisant le SybrGreen ne nécessite aucune expertise, est économique et facile. L’inconvénient principal de cette technique est l’absence totale de spécificité de la fluorescence mesurée.

Sondes

Il existe 4 technologies utilisant des sondes : Taqman ou hydrolyse de sondes, HybProbes (FRET) ou hybridation de 2 sondes, Molecular Beacons ou balises moléculaires et Scorpion ou amorces scorpion.

Taqman

Les sondes sont marquées à leur extrémité 5’ par un fluorochrome émetteur (reporter), par exemple FAM, et à leur extrémité 3’ par un fluorochrome suppresseur (quencher) fluorescent ou non, par exemple TAMRA, qui inhibe l’émission du reporter lorsqu’ils sont à proximité. Au cours de la PCR, si la sonde est hybridée sur sa cible, elle est hydrolysée par l’ADN polymérase. Le reporter ainsi séparé du quencher émet un signal proportionnel au nombre de sondes hydrolysées, mesurable au moment de l’élongation. La spécificité de la réaction est liée à la fois à celle des amorces et à celle de la sonde réduisant significativement l’émission de fluorescence non spécifique due à des mésappariements ou des dimères d’amorce . Cependant, le risque d’avoir de faux négatifs est beaucoup plus élevé qu’avec les agents intercalants, des mutations dans la région reconnue par la sonde risquant d’entraîner un défaut d’hybridation et donc l’absence de détection. Cette technique présente par ailleurs l’avantage de détecter plusieurs cibles dans le même tube en utilisant différentes sondes marquées avec des fluorochromes ayant des spectres d’émission différents (multiplexage).
Cette technique est très sensible, très spécifique, rapide et permet le multiplexage mais elle manque d’efficacité et de flexibilité lors de mutations variables ou localisées dans les régions comportant des séquences répétées.

 

FRET

Dans ce système, on utilise 2 sondes dont l’une est porteuse en 3’ d’un fluorochrome émetteur et l’autre en 5’ d’un fluorochrome accepteur. Les sondes sont choisies de façon à s’hybrider à leurs séquences cibles en n’étant séparées que de 1 à 5 bases. Lorsque les deux sondes sont séparées, le fluorochrome donneur n’émet qu’un bruit de fond de fluorescence alors que lorsqu’elles sont hybridées à moins de 10 nucléotides de distances, la proximité des 2 fluorochromes permet le transfert de l’énergie du fluorochrome donneur vers le fluorochrome accepteur provoquant l’émission fluorescente de ce dernier (FRET : fluorescent resonnance energy transfer). On mesure alors l’acquisition de la fluorescence, proportionnelle à la quantité d’ADN synthétisée, au moment de l’hybridation. Les sondes restant intactes (contrairement aux sondes Taqman qui sont hydrolysées), il est possible de réaliser une courbe de fusion en fin de réaction.
Les sondes FRET sont d’une excellente sensibilité et sont dotées d’une grande capacité de multiplexage mais leur prix est élevé et la présence de mutations non identifiées peut déstabiliser leur hybridation et donc l’interprétation de la réaction.

Molecular Beacons

Il s’agit de sondes d’hybridation en épingle à cheveux portant 2 fluorochromes, un reporter et un quencher comme les sondes Taqman. Etant repliées à l’état libre, elles n’émettent pas de fluorescence en raison de la proximité des 2 fluorochromes. Lorsque les sondes sont hybridées, l’éloignement suffisant des 2 fluorochromes libère le reporter permettant ainsi l'émission d'une fluorescence. La lecture de la fluorescence se fait au moment de l’hybridation. Les sondes restent intactes en fin de réaction avec le même avantage que pour les sondes FRET mais leur conception est plus délicate, particulièrement au niveau du tronc. Ces sondes présentent une grande spécificité permettant de détecter une variation de l’ordre de un nucléotide mais leur prix est très élevé.

 

Scorpion

C’est une variante des molecular beacons avec une structure en épingle à cheveu complétée après le quencher d’une molécule d’hexéthylène glycol (HEG) sur laquelle est fixée une amorce. L’HEG empêche l’extension de la balise moléculaire par l’ADN polymérase et l’amorce permet d’intégrer la balise moléculaire dans le nouvel amplicon. La boucle change de conformation (retournement rappelant la queue d’un scorpion) lors d’une renaturation, pour s’hybrider à sa séquence complémentaire sur l’amplicon, permettant l’éloignement du quencher et l’émission du reporter. Ces sondes présentent une grande sensibilité et une grande spécificité. Ce système est préféré lors de PCR comportant des cycles courts. Leur conception est délicate et leur prix élevé.

Mesure du cycle seuil

Pour déterminer la positivité d’une PCR et/ou quantifier un échantillon par PCR en temps réel, on détermine le nombre de cycles à partir duquel le produit PCR est détectable. Le moment d’apparition de ce signal seuil dénommé cycle seuil ou Ct (Cycle threshold) est dépendant de la quantité de matrice initialement présente dans l’échantillon amplifié. Le Ct calculé est inversement proportionnel au logarithme décimal du nombre de copies initiales. Il apparaît toujours au cours de la phase exponentielle de la PCR.

Le résultat d’une PCR en temps réel est représenté graphiquement sous forme de courbes sigmoïdes.

Chaque courbe correspond à un échantillon. Elle représente la mesure de la fluorescence de cet échantillon pour chaque cycle.
Le signal seuil calculé automatiquement est matérialisé sur le graphe par une ligne horizontale.

Courbe de fusion

La courbe de fusion permet de vérifier qu'il n'y a qu'un seul produit de PCR amplifié. Elle est réalisée en soumettant les amplicons à une température progressant de 55°C à 95°C par palier de 0,5°C et en mesurant l'intensité de fluorescence en continu. Elle correspond à la variation de la fluorescence en fonction de la température.

La température de fusion des amplicons appelée Tm est représentée par un pic unique sur la dérivée primaire de cette courbe. Dans l’exemple ci-dessus, tous les échantillons ont un Tm d’environ 81,5 °C.
Si l’on obtient plusieurs pics à des températures différentes ou des pics décalés par rapport au Tm attendu, c’est que l’on est en présence d’un mélange d’amplicons ou d’amplicons ayant une séquence différente. Il est recommandé en cas de doute de procéder à une électrophorèse du produit PCR obtenu pour vérifier la présence et la taille des amplicons.

Courbe de fusion SybrGreen

Courbe de fusion FRET

Applications

La PCR en temps réel est utilisée pour de nombreuses applications telles l’analyse d’expression de gènes, de mutations, de réponse cellulaire à différentes substances, de génotypage, de détection et quantification rapide d’agents pathogènes, de quantification d’ADN et d’ARN, d’essais d’expression et de distribution pour la thérapie génique, de quantification du nombre de copies dans une collection de cellules et d’évaluation d’ADN résiduel.
A l’ILM, la PCR en temps réel est utilisée notamment à des fins diagnostiques et/ou de recherche pour la détection et/ou la quantification des virus de dengue, chikungunya, West Nile...

Sources
  • Poitras E., Houde A. La PCR en temps réel : principes et applications. Reviews in Biology and Biotechnology. 2002 Dec, 2(2): 2-11.
  • Ameziane N., Bogard M., Lamoril J. Principes de biologie moléculaire en biologie clinique. Elsevier. 2006; 705 pages. ISBN :2-84299-685-2